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人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒

更新時(shí)間:2022-07-25      瀏覽次數(shù):1209

本試劑盒用于體外檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 VEGF)的含量。 實(shí)驗(yàn)原理: 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 VEGF)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。 用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺 和樣品中的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測(cè)定吸光度(OD 值), 計(jì)算樣品濃度。 樣本處理及要求: 1. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上 清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分 鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè) 量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織 樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑) 加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍 融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或 -80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 需要而未提供的試劑和器材: 1. 酶標(biāo)儀(450nm) 2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒溫箱 4. 蒸餾水或去離子水2021 本試劑盒只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷 3 試劑盒組成: 名稱 96 孔配置 48 孔配置 備注 微孔酶標(biāo)板 12 ×8 12 ×4 標(biāo)準(zhǔn)品 0.3mL*6 0.3mL*6 樣本稀釋液 6mL 3mL 檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋 底物 A 6mL 3mL 底物 B 6mL 3mL 終止液 6mL 3mL 封板膜 2 2 說明書 1 1 自封袋 1 個(gè) 1 個(gè) 備注1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:2000、1000、500、250、12562.5 pg/ml 2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過程中 直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標(biāo)本 進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 注意事項(xiàng): 1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃。 使用后立即冷藏保存試劑。 2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干 燥掉。 3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響 OD 值。 4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。 5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。 6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。 8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng) 試劑的生物活性。 9. 不能使用過期產(chǎn)品。 10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。 試劑準(zhǔn)備:2021 本試劑盒只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷 4 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。 20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。 操作步驟: 1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回 4℃。 2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL3. 樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL;空白孔不加。 4. 除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。 5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置 1min,甩去洗滌液,吸水 紙上拍干,如此重復(fù)洗板 5 次(也可用洗板機(jī)洗板)。 6. 每孔加入底物 A、B 50μL,37℃避光孵育 15min。 7. 每孔加入終止液 50μL,15min 內(nèi),在 450nm 波長處測(cè)定各孔的 OD 值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計(jì)算出樣品的濃度。 (此圖僅供參考) 試劑盒性能: 1. 檢測(cè)范圍:62.5 pg/ml – 2000 pg/ml2. 靈敏度:檢測(cè)濃度小于 10 pg/ml。 3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。 4. 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ,板間變異系數(shù)小于 15%

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